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超氧化物歧化酶應用於美容保養品之評估
瀏覽數:340+ | 2018-12-28
撰文者 | 中國醫藥大學醫學系生化學科退休教授何恒堅
內容及圖片來源 | 中國醫藥大學醫學系生化學科退休教授何恒堅
摘要
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,簡稱SOD)是最為人熟知的抗氧化酵素;在呼吸作用(Respiration)過程中,不可避免會產生自由基超氧陰離子(Superoxide anion),細胞內的SOD會清除超氧陰離子,保護細胞免於受傷害。以香椿葉製成的SOD原料富含SOD,電泳分析顯示原料之蛋白質組成極為單純,原料性質非常穩定,而且具有熱穩定性;生物活性評估顯示本原料具備抗氧化、美白、抗光老化、細胞損傷後之促進修復等特性,安全性評估顯示無皮膚刺激性;使用本原料所製備的美容保養品,其功效在使用者也獲得印證。
 

前言(Introduction)
當我們吸入氧氣(O2)進行新陳代謝時,氧氣如果不正常獲得一個電子,就會產生自由基超氧陰離子。超氧陰離子會危害細胞,例如造成蛋白質與脂質過氧化(Peroxidation)1,2;SOD是細胞內對抗超氧陰離子的第一道防線,SOD會將超氧陰離子轉變為過氧化氫(Hydrogen peroxide)與氧氣,然後藉著過氧化氫酶(Catalase)將過氧化氫轉變為水與氧氣;因此SOD與Catalase均屬於抗氧化酵素(Antioxidant enzyme)。

紫外線輻射(UV radiation,UVR)會造成空氣中的氧氣形成自由基,包括超氧陰離子3。許多研究報告指出自由基與皮膚老化(Aging)有密切相關4,5,造成外在皮膚傷害(Extrinsic skin damage)的環境因素中,UVR占了80%;自由基與皮膚癌相關性的研究報告更是不勝枚舉6,然而皮膚表面並無外在性的SOD。

香椿具有極佳的抗氧化性,亞蔬中心檢測150種亞洲蔬菜,香椿的抗氧化能力排名第一;與其它植物相比,香椿葉含有高量的SOD,因此本實驗室選用香椿葉為材料,製備抗氧化酵素SOD原料。
本文旨在介紹此種新開發的酵素原料。一、分析原料中之蛋白質種類與熱穩定性;二、對此原料進行生物活性與安全性評估;三、以此原料製成美容保養品,以膚質不好女性為對象,評估使用後之成效。
 

材料與方法(Material and Methods)
香椿葉購自新竹縣竹東鎮劉信賢先生栽種之有機香椿。

SOD活性分析一種方式是定量分析,用SOD活性分析套組(Activity assay kit)測溶液中SOD活性,單位是U/ml;另一種方式是定性分析,直接在電泳膠片(Electrophoresis gel)進行活性染色(Activity staining)7

SOD原料評估包括生物活性與安全性評估。

生物活性評估一、抗氧化分析;二、美白(抑制酪氨酸酶活性分析);三、人類皮膚細胞抗光老化分析;四、受損角質細胞之促進修復。

安全性評估參考OECD439,分析皮膚刺激性。

抗氧化分析將ABTS (2,2'-azinobis-3-ethyl benzothiazoline-6-sulphonic acid,14 mM在水中)與過硫酸鉀(potassium persulfate,4.9 mM在水中)等體積混合,置於室溫下避光16小時,以產生ABTS陽離子自由基(radical cation);使用前先用甲醇稀釋溶液,使其在734 nm之吸光值達到0.7左右;先將0.1 ml之ABTS溶液加入96孔盤(96-well plate)的凹槽(well)內,然後取0.1 ml之待測樣品加入ABTS溶液中,靜置30分鐘後,用微量盤分光光譜儀(Microplate reader)讀取734 nm之吸光值。

抑制酪氨酸酶活性分析將50 ml (10 Units)蘑菇酪氨酸酶(Mushroom tyrosinase,在100 mM phosphate buffer pH 6.5中)與50 ml待測樣品加入96孔盤中,在37℃加熱5分鐘後,加入0.1 ml酪氨酸(2-mM L-Tyrosine)溶液作用15分鐘後,用微量盤分光光譜儀讀取492 nm之吸光值。

抑制UVA誘導MMP1表現分析所用的是人類皮膚纖維母細胞株(skin fibroblast cell line)CCD966SK,在24孔盤(24-well plate)的凹槽內,種入5x104 CCD966SK細胞。細胞先用PBS清洗,然後曝露於UVA (輻射劑量10 J/cm2),未經輻射處理的對照組則用鋁箔遮蓋;處理後的細胞先用PBS清洗,然後加入含有待測樣品的培養基(Medium)處理24小時;最後用ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)測上清液(Supernatant)中MMP1 (Matrix metalloproteinase 1)含量,用微量盤分光光譜儀讀取450 nm之吸光值。

細胞存活率(Cell viability)用定量比色法來測定;在活細胞內,MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)會轉變為紫色的formazan dye,溶於DMSO (dimethylsulfoxide)中,用分光光度計(Spectrophotometer)讀取550 nm之吸光值。
 

結果(Results)
SOD原料之全蛋白質(Total proteins)與熱穩定性(Thermostability)分析
本實驗用電泳來分析SOD原料中的蛋白質成分,圖一(A)是蛋白質染色(Protein staining)之結果;顯示原料的蛋白質組成極為單純,分子量介於10~15 kDa之間,屬於一群小蛋白質,有趣的是這群蛋白質呈現規則性階梯狀(Ladder)排列。此外,在電泳膠片直接進行活性染色,令人訝異的是這群小蛋白質全部具有SOD活性,結果請見圖一(B)。
已經有許多研究報告指出SOD具有熱穩定性,本原料在50~80℃處理30分鐘,圖一(C)顯示與不加熱之對照組(Control)相比,加熱後之各實驗組其SOD活性完全不受影響;進一步用電泳分析,圖一(D)(蛋白質染色)的結果顯示與對照組相比,加熱並不會造成SOD分解或減少;在圖一(E)中,電泳膠片活性染色的結果也顯示:SOD之活性,並不會因加熱而有影響,此結果與圖一(C)相符。



長時間之熱穩定性(Long-term thermostability)測試
將SOD原料置於50℃長時間加熱處理,以測試本原料是否適宜長時間、長距離運輸,分別在8天、15天、21天、30天,用電泳比較加熱後之原料與不加熱之對照組;在圖二(A)與(B)之蛋白質染色(左)與電泳膠片活性染色(右),兩者皆顯示加熱8天與15天對於本原料並無影響;圖二(C)之結果顯示經過21天加熱處理,分子量較大的SOD有少部分開始分解;比較明顯的變化是在加熱30天,分子量較大的SOD分解程度增加,結果請見圖二(D)。



抗氧化分析與美白評估
SOD原料具有抗氧化性,在圖三(A)中隨著原料濃度增加,抗氧化性明顯上升,IC50約5.2 mg/ml,相較於圖三(B)對照組Vitamin C (IC50約4.1 mg/ml),兩者差異並非很大;當兩者之濃度提高到10 mg/ml時,均可達到近乎100%之抗氧化性。
圖三(C)的結果清楚說明SOD原料有抑制酪胺酸脢的效果,IC50約39 mg/ml,而圖三(D)對照組麴酸(Kojic acid)之IC50約6.25 mg/ml (0.044 mM);表面上看來兩者的IC50差距頗大,但是必須考慮SOD原料並非單一成分,與單一成分的麴酸不同。



抗光老化分析與皮膚刺激性試驗
有研究報告指出80%皮膚老化,原因是來自於光老化(Photoaging)4;紫外線照射會誘導MMP1表現(Expression),分解膠原蛋白。圖四(A)的結果顯示在SOD原料(100 mg/ml以內)存在下,細胞用UVA照射後之存活率與單獨用UVA照射之存活率並無明顯差異;當SOD原料濃度提高到200 mg/ml時,細胞存活率仍達85%以上,一般界定存活率達85% (下方虛線)為無毒。

在SOD原料存在下,UVA照射誘導MMP1的表現量,很明顯會受到抑制。在圖四(B)中可看出單獨用UVA照射細胞,與不經輻射處理的對照組相比,MMP1的表現量上升(140% vs. 100%);然而隨著SOD原料濃度上升,MMP1的表現量明顯下降,在100-mg/ml SOD原料存在下,MMP1的表現量甚至低於不經輻射處理的對照組;當SOD原料提高到200 mg/ml時,與單獨用UVA處理相比,抑制效果更加明顯(140% vs. 50%)。

在基因層次(Gene level)上,SOD原料會抑制UVA照射誘導MMP1的表現;而在蛋白質層次(Protein level)上,SOD原料會直接抑制MMP1的活性,類似上述之酪胺酸脢,圖四(C)的結果明顯可看出此種效應,IC50約79.5 mg/ml。

圖四(D)代表SOD原料對於皮膚刺激性測試的結果,相較於PBS (Negative control),5% SDS (Sodium dodecyl sulfate,Positive control)有明顯刺激性(100 ± 1.7% vs. 1.6 ± 0.3%);1% SOD原料(10 mg/ml)則無刺激性(104.5 ± 1.3%),SOD原料提高至5% (50 mg/ml)也無刺激性(106.5 ± 5.2%),依據OECD439規範判定為無皮膚刺激性 (no category)。



受損角質細胞之促進修復
細胞受到外力損傷,原本就有自我修復(Repair)的能力。本實驗所用的是人類皮膚角質細胞株(Keratinocyte cell line)HaCaT,SOD活性是10 U/ml;在圖五(A)中兩組中間地帶的細胞被刮除,兩側的細胞就會受到損傷,細胞修復的速度愈快,往中間空白帶移動的速度也愈快;圖五(B)比較16小時之結果,對照組中間空白帶還很明顯;然而在SOD原料存在下,細胞移動的速度明顯加快,中間空白帶幾乎已經癒合,顯示SOD原料具有促進細胞修復的效果。



SOD原料的保養品之功效性評估
限於篇幅,只能以四位女性使用含有SOD原料的保養品,來說明其功效性,保養品中SOD的活性是2.5 U/ml。
圖六(A):使用者平常沒有使用保養品的習慣,臉上肝斑嚴重,使用十六週後有明顯淡斑效果,此種類型使用者需要較長時間才能呈現效果。
圖六(B):太田母斑患者,左側顴骨處有明顯凹陷與縐摺,使用一個月顴骨處變為平坦,母斑也淡化。
圖六(C):過敏性患者,過敏時間超過一年,原因不明,嘗試過中西醫治療均無成效,使用三週過敏情況大幅改善。
圖六(D):閉鎖性粉刺患者,使用四週情況大幅改善。


 

結語(Conclusion)
綜合以上之結果,可歸納出SOD原料的特點:一、蛋白質成分單純。二、良好的穩定性。三、具有不同的生物活性。四、無皮膚刺激性。

使用SOD會有極大助益:一、沒有任何小分子催化劑,催化反應的速率能與酵素相比。二、SOD的轉換數(Turnover number)是100萬,亦即一個SOD分子每秒鐘可以清除100萬個超氧陰離子自由基,目前尚未有任何抗氧化物(Antioxidants)清除自由基的速度能與其相比。三、沒有毒性,SOD含量提高10倍(25 U/ml,與圖六相比),只會增加功效而已;然而小分子的化學成分濃度太高,會產生反效果。

酵素應用於化妝品產業是必然的趨勢,期盼台灣化妝品產業能真正提升至生物技術(Biotechnology)層次,謹以此文共勉。
 
參考文獻(References)
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Figure legends.
  • SOD原料之分析。A與B是蛋白質組成分析,A是蛋白質染色,B是活性染色,在B中有SOD活性的區域以右下方Bracket表示,Lane 1是SOD原料,Lane M是Prestained protein marker,分子量標示於左方(單位:kDa),以下之電泳分析則省略Lane M;C~E是熱穩定性分析,SOD原料在50~80℃處理30分鐘,C是用活性分析套組測定每個樣品中SOD活性(U/ml),Control是未加熱樣品;D與E是未加熱與加熱樣品之電泳分析,類似A與B,在E中有SOD活性的區域以右下方Bracket表示。
圖二、SOD原料之長期熱穩定性測試。原料置於50℃加熱,在A~D中,左圖是蛋白質染色,右圖是活性染色;Lane 1是未加熱樣品,Lane 2是加熱後的樣品,加熱天數標示於圖上方。
圖三、SOD原料之兩種生物活性測試。A與B是抗氧化分析,Vitamin C是比較組;C與D是抑制酪氨酸酶活性分析,麴酸是比較組,注意麴酸濃度單位是mM。
圖四、SOD原料之抗光老化測試與安全性評估。在A與B中,UVA的輻射劑量是10 J/cm2,未經輻射處理的對照組以C表示,單獨用UVA處理的組別以UV表示;A是比較各組細胞存活率,下方虛線表示85%存活率,B是比較各組MMP1的表現量;C是SOD原料抑制MMP1活性分析,類似圖三C與D;D是皮膚刺激性試驗,PBS是Negative control,5% SDS是Positive control,SOD原料濃度標示於上方。
圖五、受損角質細胞HaCaT之修復作用比較。A與B分別是0與16小時,對照組的中間空白帶以左方Bracket表示。
圖六、含SOD原料之保養品功效性評估。A、肝斑;B、太田母斑;C、長期過敏;D、閉鎖性粉刺,使用保養品的時間標示於圖上方。

本文由
中國醫藥大學醫學系生化學科退休教授何恒堅提供。
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